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PCR
在分析qPCR实验Ct值时，可能会出现以下这几类问题：
1.复孔间重复性差，操作原因？
2.无模板阴性对照出现Ct值时，目的基因的Ct值是否能用？
3.CT值很大怎么办？
那么，假如碰到这些问题我们该怎么办？今天就和大家聊一聊这些常见CT值问题的解决办法。
复孔间重复性差
首先，我们来谈谈复孔间重复性差的问题，复孔间重复性差一般会有以下两种情况：
（1）Ct值＜30，重复性较差，这种情况与操作有一定关系。
这种情况可以从以下几个方面分析：加样准确度；移液器吸取液体的准确度；定期校准qPCR仪
1.加样准确度
① 避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O 配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液 cDNA 添加 1 μL，可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍，添加 5 μL，使用 ddH2O 补齐体系至 20 μL 即可。
② SYBR Green Mix、配置的混合体系需要混合均匀。从 -20 ℃ 冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在一起的 Mix 用移液器吹打混匀。
2.移液器吸取液体的准确度
① 移液器量程定期校准，校准周期为 1 年。
② 购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导致吸取量程不准确。
③ 在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。
3.定期校准PCR仪
① 一般每一年都需要对PCR仪校准一次。
（2）Ct值＞30，重复性差。这种情况符合松柏分布，即在有效模板很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的Ct值差异较大。
在出现这种情况时，我们可以看看溶解曲线是否有杂峰，如果无杂峰，无模板阴性对照同目的基因的△Ct值为3or5以上，那Ct值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的Ct值参与计算。
无模板阴性对照（NTC）出现Ct值时，目的基因Ct值是否能用？
当出现这种问题，也能分为两种情况去考虑：
（1）通过观察融解曲线，NTC 与目的基因融解曲线峰形不重叠。一般 NTC 的 Tm 值较目的基因 Tm 值小。
这种情况下，NTC 的Ct值是由引物二聚体造成的，并不影响目的基因 Ct 值的采集。
（2）NTC与目的基因融解曲线峰形重叠。NTC的Tm值等于目的基因的Tm值。
这种情况下，说明体系已被气溶胶污染了。那么，体系被污染，目的基因的 Ct 值还能正常使用吗？
需要计算目的基因的 Ct 值与 NTC 的 Ct 值的差值（△CT）来判定。
若 △Ct ≥ 5，说明气溶胶带来的污染对体系影响非常小，可以忽略不计。
如果达不到 △Ct ≥ 5 的程度，△Ct ≥ 3 也可以认为气溶胶的污染程度很低，目的基因的 Ct 值可正常使用。
若 △Ct ＜ 3，说明污染已经很严重了，目的基因的 Ct 值是不能使用的。
Ct值很大
Ct值偏大的原因，可以分为以下两种情况来进行讨论：
（1）相同体系，前期实验 Ct 值正常，本次实验，所有基因扩增 Ct 值皆偏大。
这种情况下，需要排查 RNA 是否存在降解。如何判定 RNA 是否存在降解呢？可通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
完整度好的 RNA 是有三条带的，以真核生物为例，三条带分别是 28s、18s、5s，且 28s 条带的亮度是 18s 的两倍，5s 最暗（下图左）。
如果 RNA 发生降解，会出现三条带的亮度发生变化，甚至不存在完整的三条带。如果 28s 几乎看不到了，整个泳道 Smear 严重，说明 RNA 的降解已经很严重了，此时 RNA 不建议用作后续的逆转录实验（下图右）。重新提取 RNA 重复实验。
（2）该基因第一次扩增，其 Ct 值偏大，而其余基因的 Ct 值正常。
这种情况下就需要判定是因为基因的扩增效率低导致的 Ct 值偏大，还是基因本身的表达量低造成的 Ct 值偏大。
如何判定是因为基因的扩增效率低导致的 Ct 值偏大，还是基因本身的表达量低造成的 CT 值偏大呢？首先需要计算引物的扩增效率。
可将基因的扩增产物进行梯度稀释（至少三个梯度，且梯度之间的 △Ct 均一，防止因为操作原因导致标准曲线线性关系差，进而影响扩增效率的计算），同时进行 qPCR。将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。
关于引物扩增效率的计算，可参考下面的案例：
① qPCR 扩增：
将qPCR产物进行原液、1/10、1/100 梯度稀释，每个梯度设置三个复孔，进行 qPCR 扩增，复孔间 Ct 值取平均值，得到三组 Ct 值。
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模板原液 | 稀释1/10的模板 | 稀释1/100的模板 |
| 平均Ct值 | 23.69 | 27.04 | 30.27 |
② 标准曲线绘制及扩增效率计算：
可以在 excel 上进行扩增效率的计算。稀释梯度可以设置为 -1、-2、-3，每个梯度对应的 Ct 值分别为 23.69、27.04、30.27，如下图，进行标准曲线绘制。
通过标准曲线可以得到线性方程（y = -3.29 x + 20.42）与 R2 值（R2 = 0.9999）。将线性方程得到的斜率（-3.29）带入扩增效率计算公式中：，即可得到扩增效率：101.35%。
只有当扩增效率满足 90~120%，且标准曲线 R2 ≥ 0.99，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的 Ct 值才可以用来计算。且扩增效率越接近 100%，引物的扩增性能越优。
若扩增效率不满足 90~120%，那 CT 值偏大是因为扩增效率不达标导致的，需要重新设计引物。
若引物的扩增效率满足 90~120% 前提下，Ct 值仍然很大，则是基因本身表达量低造成的 Ct 值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的方法是改为探针法进行定量。探针法的灵敏度是高于染料法的。
- 上一个：浅谈一些qPCR问题及解决方案
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