原核表达原理、步骤、载体构建、常见问题分析

本文从原核表达的原理讲起，再结合具体实例，给大家介绍了原核表达步骤、载体构建以及常见的一些问题并给出了相关的解决方案，便于初学者能够快速了解掌握原核表达。

在基因工程领域，我们常说的原核表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因克隆到原核质粒并导入表达宿主菌进行诱导表达的过程。在原核蛋白表达体系中，最常用的就是大肠杆菌表达系统，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，常用诱导剂 IPTG，乳糖等诱导方式，其中IPTG是最常用的诱导方式，以IPTG诱导原核表达为例：

IPTG诱导原核表达原理

IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，因此两者均可以作为原核表达的诱导剂。IPTG在作为诱导剂参与原核表达的进程，单其本身并不被消耗，只是化学反应的一个中间物质。

原核表达的组成原件

完整的原核表达系统通常包括表达质粒，宿主菌株，诱导剂，纯化或检测标记等原件。

选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达产物形式，目标蛋白的活性，产物的纯化工艺等。

原核表达的优缺点

原核表达步骤过程

一、目的片段的获取

1.1引物设计

以下内容以猪HKX基因为例进行阐述

在NCBI上查找到的目基因mRNA CDS区序列（1490 bp），使用Primer Premier 5.0软件进行引物的设计，在设计引物时，上下游引物的5’段均引入合适的酶切位点和保护性碱基。

1.2 PCR扩增

1.3琼脂糖凝胶电泳胶回收PCR目的片段

根据目的条带大小配置相应浓度的琼脂糖凝胶，微波炉加热完全溶解后，冷却至60℃左右，按照1：20000加入4S green染料，混匀后倒入凝胶铸槽中，插入梳子，除去气泡，待完全凝固后拔出梳子。

将凝胶置于电泳槽中，加样孔放置于负极，进行加样（选取合适的DNA Marker）。100V，100 mA电泳40 min，根据DNA Marker指示条带在凝胶上的位置决定电泳是否终止。然后将凝胶放置在凝胶成像仪中切胶回收。

二、表达载体的准备

不同的表达载体具有不同的优势，在分析基因序列之后可以选择最佳的表达系统进行重组表达质粒构建。因科研需求，需要pET系列、pGEX系列、pCold I~IV、pCold(BL21分子伴侣)系列等原核表达载体，亦可选择我们的实物外包服务：原核表达。

2.1表达质粒准备

例：接种转化有pCold I的DH5α菌种，按照1：100接种到4mL LB中，加入氨苄青霉素（终浓度50 μg/mL），37 ℃ 220 rpm培养过夜，提取新鲜质粒。

2.2载体及PCR产物双酶切

选择合适的酶切位点，对目的片段和表达载体进行酶切反应。

例：

37 ℃消化15 min，之后进行胶回收。

A：HKX PCR条带约1500bp

B：pCold I载体双酶切结果约4400bp

2.3连接反应

将胶回收得到的PCR产物和载体进行连接。

16 ℃连接2 h载体摩尔比例在10：1到3:1之间。

三、目的蛋白的表达

3.1连接产物转化DH5α

使用合肥知恩生物技术有限公司的DH5α细胞来进行连接产物转化。

a.从-80℃取出DH5α感受态细胞，放在冰上融化；

b.将10 μL连接产物全部加入到100 μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min；

c.将EP管放在42 ℃热水中热激90 s，再放回冰上2-3 min；

d.在EP管中加入400 μL 预热的LB培养基，置于摇床上，37 ℃、200 rpm培养1 h；

e.将转化后的菌液离心后保留100 μL均匀涂至LB固体培养基上（氨苄霉素抗性，终浓度50 μg/mL），37 ℃恒温培养箱先正置5 min，然后倒置培养过夜。

转化后挑选阳性克隆质粒，经测序鉴定无误后进行后续诱导表达实验。

3.2提取质粒转化BL21分子伴侣

1.将鉴定正确的表达重组质粒转化BL21分子伴侣感受态细胞（和转化DH5α同理）。

2.挑取单菌落接种至4 mL培养瓶中（含终浓度为50 μg/mL的氨苄霉素，50 μg/mL氯霉素），37 ℃，220 rpm培养过夜；

3.将过夜培养的菌液以1：100的比例接种于500 mL LB培养瓶中（含终浓度为50 μg/mL的氨苄霉素，50 μg/mL氯霉素）。待OD₆₀₀=0.4-0.6时，将菌液放于4 ℃冰箱20 min，再放入15 ℃摇床静置20 min，降温；

4.吸出500 μL菌液作为未诱导对比 ，向剩余菌液中加入终浓度为0.1 mM IPTG，未诱导的菌液与诱导的菌液，15 ℃，24 h培养。

3.3超声破碎菌液

收集培养24 h后的菌液(10000 rpm，20 min，4℃)，用PBS洗涤一遍，之后进行浓缩（浓缩比例约20：1），超声破碎20 min，结束后4 ℃、12000 rpm、30 min离心分别收集上清和沉淀，将所作对照组进行同样的处理。

取诱导前全菌，诱导后全菌，诱导后上清，诱导后沉淀等各40 μL，加入10 μL 5×loading buffer，煮沸10 min，冰浴2-3 min，进行SDS-PAGE电泳分析，确定表达产物是可溶性的存在于上清还是包涵体形式存在沉淀中。若是可溶性的之后则进行蛋白纯化，若是包涵体则进行蛋白变复性。

IPTG诱导蛋白A表达结果：

A：蛋白A-pCold-BL21分子伴侣IPTG诱导前全菌

B：蛋白A-pCold-BL21分子伴侣IPTG诱导后全菌

C：蛋白A-pCold-BL21分子伴侣IPTG诱导后上清

D：蛋白A-pCold-BL21分子伴侣IPTG诱导后沉淀

蛋白纯化步骤简介：

a.按照样品：镍平衡液为1:3体积混匀；

b.吸取1 mL镍柱，使用15-20 mL平衡液洗涤（含有20 mM咪唑）；

c.上样：将处理后的样品加入镍柱中，使其缓慢流下，约0.5 mL/min；

d.重复c步骤一次，流速可加快至1-2ml/min；

e.洗杂：使用15-20 mL  洗杂液（含有50 mM咪唑）洗杂；

f.洗脱：缓慢加入洗脱液（含有300 mM咪唑），慢慢收集流出的液体，分步收集，每500 μL收集一管，分别测定浓度。

最终纯化后的蛋白，脱盐后进行SDS-PAGE检查，评价纯化效果。

原核表达中常见问题及解决办法

一、不知道蛋白的特性和结构

首先确定这些蛋白质是否有人研究过?还是最新发现的蛋白？如果没有人研究过，那就先测部分氨基酸，然后设计引物克隆。如果有人研究过，那就可以根据软件来预测。如果有swiss-pdb软件，但这个是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以再NCBI上进行blasts，得到蛋白。

二、表达菌株的选择

原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此真核基因中的密码子对原核系统来说可能是稀有密码子，影响目的蛋白的表达，因此我们针对不同的问题选择不同的表达宿主菌。

三、质粒测序正确无法表达

如果稀有密码子，如果比较多，可以尝试rosetta（DE3）菌株，可能是基因本身的问题。这种情况的出现大多由于RNA3’的特殊结构导致，因此我们可以尝试融合表达，譬如pET-32a。另一原因可能是蛋白表达量过低，western blot，定性的检测后，即可得出结论。

四、如何提高重组蛋白表达在原核细胞里的表达水平，特别是可溶性表达？

比较普遍的方法有基因优化，载体宿主优化筛选，表达条件优化，诱导条件优化等。降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。

4.1密码子优化

根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选，其目的是为了提高mRNA二级结构的稳定性，提高新生肽段的正确折叠，有助于外源活性蛋白的表达。

4.2表达温度的选择

大肠杆菌的最适生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，影响蛋白的可溶性表达，因此为了增加可溶蛋白的比例，低温培养条件下表达外源蛋白是一个重要条件。

4.3诱导条件优化

摇瓶培养时，大多数会选择低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。流加诱导剂在特定情况下也能显著提高可溶蛋白的表达水平。

五、目的蛋白总是以不可溶的形式出现

在原核表达中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实践中，有很多实验室采取降低诱导温度，例如25–30 °C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1 mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。然而，让目的蛋白以包涵体形式聚集也并非总是坏事。

不溶态在某些情况下非常有利：

1.形成包涵体是目的蛋白表达量很高的表现。

2.作为初步分离，将目的蛋白的包涵体纯化出来非常简便。用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达75–95%的目的蛋白。

3.存在于包涵体中的目的蛋白通常可以免于蛋白酶的水解破坏作用。

研究者采用下述方法加强蛋白重折叠的效果，并在很多蛋白上取得了好结果，可以尝试以下：当蛋白还结合在树脂上时，使用6 M–8 M梯度盐酸胍、1 mM还原性及0.2 mM氧化型谷胱甘肽处理，继而用咪唑正常洗脱。有些实验室在透析去除变性剂的过程中加入底物或类似物，也有帮助酶折叠的效果。

六、His标签包在蛋白质结构内部还能用蛋白酶切除吗？

重组蛋白纯化标签一般被包在内部，可以增加所提的蛋白质样品的溶解度，适量增加变性试剂浓度或类型可以使得蛋白质的肽链松散开暴露出（组氨酸）6标签。另外，还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型，加大DTT浓度（DTT浓度<1 mmol/L，否则DTT会与Ni2+结合），适当调整调高盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L，从低浓度到高浓度逐渐分梯度上升），因为His-6的亲水性较强，增加可溶性之后His6容易暴露在水相,从而增加蛋白质的可溶性。加大DTT浓度也可以切断二硫键使得蛋白质的肽链松散，进而使His-6容易暴露在水相，从而方便纯化和酶切。如果以上条件都无法满足实验要求，建议不加His-tag，重新构建。

七、目的蛋白大于100 kd或含有多个亚基，是否可以用原核表达系统？

先例表明很多大蛋白已经在细菌中非常成功底表达了。多亚基复合物则可以通过分别表达各亚基，然后在有尿素的溶液中，将各组分以适当比例混和，再透析除去变性剂。

八、如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？

重组蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。

九、E. coli会去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸吗？这种加工对目的蛋白的稳定性有何影响？

N-端fMet是否被去除受倒数第二个氨基酸影响。这个加工过程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下关系支配：去除的困难程度随倒数第二位氨基酸的支链大小的增加而降低。研究者在实验中发现以下氨基酸种类出现在倒数第二的位置上时，此加工过程极少发生或根本没有发生：His、Gln、 Glu、Phe、Met、Ly、Tyr、Trp和Arg。而当倒数第二位上是其它种类的氨基酸时，加工过程发生的可能从16%到97%，Tobias等人 确定了在大肠杆菌中蛋白氨基末端氨基酸与其稳定性之间的关系，也即“N-端原则”。具他们报导：如果下列氨基酸位于氨基端时蛋白的半衰期仅为2分钟：Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端时可以使受检蛋白的半衰期长达10小时以上。综上两条研究可以得出结论：Leu在氨基末端时很容易因为fMet被去除而暴露出来，从而导致蛋白的迅速水解。显然，当采用pET载体上的 Nco I 或 Nde I位点表达非融合蛋白时，完全不必担心Leu的密码子出现在倒数第二的位置上。

十、如果目的蛋白包含信号序列，它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在？抑或目的蛋白甚至可以被分泌到生长培养基中？

N-端如果带有ompT 或 pelB 这样的前导序列是使目的蛋白进入细胞周质的必要非充分条件。如果在生长培养基中发现目的蛋白的话，多半是因为细胞壁收到破坏，而并不代表蛋白是被分泌到培养基里的。穿过大肠杆菌内膜的机制还不甚了了。已经清楚了蛋白的成熟区对转运也有影响。虽然根据紧跟在信号肽序列后的目的蛋白序列可以对其输出的可能作个大概判断；但是由于蛋白的输出效率依赖于目的蛋白的特性，还是不能仅仅根据其序列来预测输出的实际情况。因此，实验中，在细胞质中发现目的蛋白（仍然带着未被切除的信号序列）或在细胞周质中有被部分加工的蛋白，在细胞周质及其它区域发现经过其它加工的蛋白，都不足为奇。某些情况下，降低诱导时的培养温度至25–30 °C，可能提高输出蛋白的比率。