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qPCR溶解曲线分析：溶解曲线不好？峰值低？怎么办？

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2020/8/4 浏览次数：

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我们通常通过熔解曲线来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线应该是单峰，异常的熔解曲线会出现杂峰、双峰、宽峰等可能的情况，下面我们就一起分析一下：

1.双峰现象

a）双峰，较低峰Tm在80℃之前

这种情况考虑到可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。

b）双峰，双峰Tm在80℃以后

①引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。
②gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。

2. 熔解曲线单峰但不尖锐

这可能存在大小相近的非特异性产物，可以利用高分辨率琼脂糖电泳确认。

3.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前

推测未加模板，仅有引物二聚体的扩增。可利用高分辨率琼脂糖电泳确认或重复实验。

4.有扩增曲线无溶解曲线

可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。

5.熔解曲线峰型杂乱

1）反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。
2）试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。
3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。
4）耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。

6.两种试剂对比，得到的Tm值不一样
可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样，导致解链温度Tm值不一样。